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Purification

 
 
Les oligonucléotides sont synthétisés via une phase solide. Ainsi, les nucléotides sont attachés selon la séquence de votre choix au fur et à mesure de la synthèse. Il est généralement connu que les réactions chimiques n'atteignent jamais une conversion à 100%. Dans la synthèse d'oligonucléotides de pointe, des rendements de couplage de 99,5% sont atteints. Avec les 0,5 % de brins n'ayant pas réagi, l'assemblage en chaîne s'arrête et des séquences tronquées se forment comme produits secondaires.
Selon l'application prévue, il peut être intéressant d'éliminer ces séquences plus courtes. C'est pourquoi Microsynth propose différentes purifications.

Vue d'Ensemble

Dessalé

Tous nos oligos sont au moins dessalés pour éliminer en grande partie les sous-produits résiduels de faible poids moléculaire qui se forment et s'accumulent lors des réactions chimiques de synthèse. Cette purification est suffisante pour les oligonucléotides de moins de 30 bases et/ou les oligonucléotides utilisés pour des applications moins exigeantes telles que la PCR, le séquençage, probing, mobility shift ou l'hybridation. Les oligos dessalés ne sont pas recommandés pour les projets de clonage moléculaire.


Applications potentielles :

  • PCR
  • Séquençage de l'ADN
  • Probing
  • Mobility shift ou hybridation

 

HPLC Purification

Les oligos de longueur <50 bases peuvent être bien purifiés par HPLC en phase inverse. Grâce à cette approche de purification, les oligos résiduels tronqués n-x (dépourvus du groupe de protection hydrophobe DMT à l'extrémité 5') sont éliminés. Il en résulte une pureté de l'oligonucléotide ciblé ≥85%. La RP-HPLC est utile pour un niveau de pureté plus élevé requis pour des applications plus exigeantes telles que le clonage, DNA fingerprinting, la PCR en temps réel, le FISH, etc.

Applications potentielles :

  • Molecular cloning
  • DNA fingerprinting
  • Real-Time PCR
  • FISH

 

Purification HPLC et Dialyse

La dialyse en complément de la purification HPLC est recommandée si les oligos doivent être présents dans un état physiologique. Lors d'expériences in vivo (par exemple chez la souris), ce niveau de pureté est fortement recommandé.

Applications potentielles :

  • Expériences antisens
  • Études sur culture cellulaire
  • Physico-chimie et analyse de structure (RMN, MS, etc.)

 

Purification PAGE

La purification par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) est généralement nécessaire pour les oligos longs (>50 bases) et pour toutes les amorces ayant des séquences 5' critiques (sites d'endonucléase de restriction, promoteurs ARN). C'est la meilleure méthode pour différencier les oligos longs des séquences tronquées (oligos n-1), en fonction de la taille, de la conformation et de la charge. La purification par PAGE a une excellente résolution et donne un produit qui est, en moyenne, pur à ≥95%. Dans ce contexte, il est important de noter que le niveau de pureté diminue avec l'augmentation de la longueur de l'oligonucléotide, et cela est particulièrement vrai pour les oligos jusqu'à 120 bases. La purification par PAGE est fortement recommandée pour les expériences exigeantes telles que le clonage, la mutagenèse, fingerprinting ADN, l'hybridation in situ, la synthèse de gènes, etc.

Applications potentielles :

  • Clonage moléculaire
  • Mutagenèse
  • DNA fingerprinting
  • Hybridation in situ
  • Synthèse de gènes

 

Rendements pour l'ADN

 
Oligos d'ADN dessalés 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics 13 - 60 2 10 8 40 1
0.04 µmol 13 - 80 3 15 9 45 1
0.2 µmol 6 - 1504 10 50 20 100 1
1.0 µmol 6 - 80 50 250 80 400 1
15 µmol 13 - 60 700 3‘500 1000 5000 2
 
 
 
Oligos d'ADN purifiés par HPLC 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol <51 1 5 4 20 2
0.2 µmol 3 15 7 35 2
1.0 µmol 15 75 26 130 2
15 µmol 300 1'500 500 2500 4
 
Oligos d'ADN purifiés par HPLC et dialysés 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol

<51

3 15 6 30 3
1.0 µmol 15 75 20 100 3
15 µmol 200 1'000 400 2000 4
 
Oligos d'ADN purifiés par PAGE
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 13-80 0.5 2.5 6 30 2
0.2 µmol 8-80
81-1504
2
0.5
10
2.5
8
4
40
20
2
1.0 µmol 8-80 7 35 20 100 2
15 µmol not available

 

1 The synthesis scale represents the initial amount of 3' bases (starting material).
2 Guaranteed and average yields in OD are valid for unmodified oligos >20mer only.
3 Yields indicated in nmol represent an example calculation for a 20mer. For this calculation the following rule of thumb equation was applied: nmol of oligo = OD x 100/length of oligo. Please note that this calculation is based on sequences with virtually homogenous distribution of the 4 DNA bases; it may vary for sequences with high GC contents >70% etc.
4 Oligos longer than 150 DNA bases on request (we would like to discuss the proposed experiment/application with you beforehand in order to guarantee the best possible outcome)

Rendement pour l'ARN

 
Oligos d'ARN dessalés 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 10 - 30 4 21 6 28 2
0.2 µmol 10 - 504 8 35 10 45 2
1.0 µmol 10 - 504 18 80 22 100 2
15 µmol 10 - 40 400 1'800 800 2'200 3
 
Oligos d'ADN purifiés par HPLC 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 10 - 30 1 5 2 10 2
0.2 µmol 10 - 80 3 15 5 25 2
1.0 µmol 13 65 17 85 2
15 µmol 10 - 40 300 1'500 360 1'800 4
 
Oligos d'ARN purifiés par HPLC et dialysés[nbsp]
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol 10 - 80 2 10 3 15 4
1.0 µmol 9 45 11 55 4
15 µmol 10 - 40 200 1'000 250 1'250 4
 
Oligos d'ARN purifiés par PAGE
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol 10 - 504 1 5 1 5 2
1.0 µmol 10 - 504 6 30 7 30 2
15 µmol not available

 

1 The synthesis scale represents the initial amount of 3' bases (starting material).

2 Guaranteed and average yields in OD are valid for unmodified oligos >20 and <40 nucleotides only.
3 Yields indicated in nmol represent an example calculation for a 20mer. For this calculation the following rule of thumb equation was applied: nmol of oligo = OD x 100/length of oligo. Please note that this calculation is based on sequences with virtually homogenous distribution of the 4 RNA bases.

4 Oligos longer than 50 RNA nucleotides can be produced in combination with HPLC purification.